Western Blot（WB）实验是分子生物学中检测特定蛋白质的关键技术，其成功依赖于转膜、封闭、抗体孵育及显影等步骤的精准操作。以下从转膜到显影提供系统性技巧，结合常见问题及优化策略：

一、转膜技巧：高效转移蛋白质

1. 转膜方法选择

• 湿转法：适用于大分子量蛋白（>100 kDa），需预冷转膜缓冲液至4℃，转膜槽置于冰浴中，电流设置为200-300 mA，时间根据蛋白大小调整（如150 kDa蛋白转90-120分钟）。

• 半干转法：适用于小分子量蛋白（<100 kDa），需使用预平衡的转印缓冲液，电流设置为0.8 mA/cm²，时间15-30分钟。

2. 膜的选择与处理

• PVDF膜：需用甲醇活化15-30秒，再浸入转膜缓冲液平衡5分钟。

• NC膜：直接浸入转膜缓冲液即可。

• 小分子量蛋白转膜：建议使用0.22 μm孔径的膜，并缩短转膜时间。

3. 转膜效率验证

• 使用丽春红S染色液染色，观察膜上是否出现清晰条带，若目标蛋白区无条带，需延长转膜时间或调整电流。

二、封闭技巧：降低背景信号

1. 封闭液选择

• 通用型：5%脱脂牛奶（TBST配制），适用于多数蛋白。

• 磷酸化蛋白：5% BSA（TBST配制），避免酪蛋白干扰。

• 高脂蛋白：使用Odyssey封闭液或3% BSA+0.1%吐温-20。

2. 封闭条件

• 室温封闭1-2小时，或4℃过夜。避免封闭时间过长导致抗体结合位点被占据。

三、抗体孵育技巧：提高特异性结合

1. 一抗孵育

• 4℃孵育过夜（>12小时），或室温孵育2小时。

• 抗体浓度需根据说明书优化，通常1:1000-1:5000。

• 建议设置阳性对照（已知表达该蛋白的样本）和阴性对照（省略一抗）。

2. 二抗孵育

• 室温孵育1小时，避免过长时间导致非特异性结合。

• 二抗需与一抗种属匹配，如兔源一抗需用抗兔二抗。

3. 洗膜步骤

• TBST洗膜3次，每次10分钟，彻底去除未结合抗体。

四、显影技巧：获取清晰条带

1. 显影液选择

• ECL化学发光液：A液与B液按1:1混合，现用现配，避光保存。

• DAB显色液：适用于HRP标记的二抗，需在显微镜下观察显色过程，及时终止反应。

2. 显影条件

• 将膜均匀覆盖显影液，孵育1-2分钟后，用化学发光成像仪曝光。

• 曝光时间：先短曝光（10秒）观察信号，再逐步延长至最佳曝光时间（如1-5分钟）。

• 多张曝光：拍摄不同曝光时间的图像，便于后续分析。

3. 显影问题解决

• 背景过高：延长封闭时间至2小时，或降低二抗浓度至1:5000。

• 无信号：验证一抗效价（做阳性对照），或检查转膜效率（用预染Marker确认）。

• 非特异性条带：增加一抗洗脱时间（TBST洗6次×5分钟），或更换封闭剂。

五、常见问题与优化策略

六、进阶技巧

1. 内参选择

• 哺乳动物细胞：GAPDH、β-Actin。

• 植物细胞：Plant Actin、Rubisco。

• 分子量差异需≥5 kDa，确保目的蛋白与内参清晰区分。

2. 多重检测

• 使用荧光标记的一抗或二抗，结合不同荧光通道（如Alexa Fluor 488、594）进行多重检测。

3. 数据分析

• 使用ImageJ软件进行灰度值分析，计算目的蛋白与内参的比值。

通过系统优化转膜、封闭、抗体孵育及显影步骤，可显著提升Western Blot实验的成功率与重复性。结合进阶技巧，科研人员能高效应对实验挑战，获得高质量的蛋白质检测结果。