流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是一种强大的生物技术，广泛应用于细胞生物学、免疫学、肿瘤学等领域。其核心流程包括样本制备、染色、检测和数据分析。以下从样本制备到数据分析进行系统性介绍：

一、样本制备

样本制备是流式细胞术的关键步骤，直接影响实验结果的准确性和可靠性。

1. 样本类型

• 外周血：通过密度梯度离心法分离单个核细胞（PBMC），或直接裂解红细胞获取白细胞。

• 组织样本：如脾脏、骨髓等，需通过机械研磨和酶解法（如胶原酶、透明质酸酶）制备单细胞悬液。

• 细胞系：悬浮细胞直接离心重悬，贴壁细胞需用胰酶消化后收集。

2. 细胞计数与活力检测

• 使用台盼蓝染色法或流式细胞术自带的活细胞染料（如7-AAD、PI）检测细胞活力，确保活细胞比例>90%。

• 细胞浓度调整至1×10⁶ - 1×10⁷个/mL，以满足流式细胞仪的检测需求。

3. 固定与透化

• 胞内抗原检测时，需用4%多聚甲醛固定细胞，再用0.1%-0.5%皂素或Triton X-100透化细胞膜。

二、抗体染色

抗体染色是流式细胞术的核心，直接影响信号的特异性和灵敏度。

1. 抗体选择

• 选择与流式细胞仪激光器和滤光片匹配的荧光染料（如FITC、PE、APC等），并确保抗体与目标抗原特异性结合。

• 使用同型对照（Isotype Control）抗体排除非特异性结合。

2. 染色步骤

• 表面抗原染色：直接将细胞与荧光标记抗体在4℃孵育30分钟。

• 胞内抗原染色：固定透化后，用含0.5% BSA的PBS封闭非特异性结合位点，再与抗体孵育。

• 死活细胞区分：加入死细胞染料（如Zombie NIR）排除死细胞干扰。

3. 洗涤与重悬

• 染色后用PBS洗涤细胞2-3次，去除未结合抗体，最后用含1% FBS的PBS重悬细胞。

三、流式检测

流式检测需优化仪器参数，确保信号的准确采集。

1. 仪器设置

• 根据荧光染料的激发和发射光谱，选择合适的激光器和滤光片组合。

• 调整光电倍增管（PMT）电压，使阴性群体信号位于对数坐标的10¹-10²之间，阳性群体信号不超过10⁴。

2. 补偿调节

• 使用单染管（Single Stain）进行补偿调节，消除荧光染料之间的光谱重叠。

• 通过FlowJo等软件自动计算补偿矩阵，或手动调节补偿值。

3. 样本检测

• 收集至少10,000个目标细胞事件，确保统计学的可靠性。

• 对于稀有细胞群体（如干细胞、肿瘤细胞），需收集更多事件（如50,000-100,000个）。

四、数据分析

数据分析是流式细胞术的最终环节，直接影响实验结论的得出。

1. 数据预处理

• 使用FlowJo、Cytobank等软件去除粘连体（Doublets）和死细胞。

• 调整荧光信号的阈值，排除背景噪音。

2. 圈门策略

• FSC/SSC圈门：根据前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）区分细胞群体，排除碎片和细胞团块。

• 荧光圈门：根据荧光信号强度，区分阳性和阴性细胞群体。

• 逻辑门（Boolean Gates）：通过多参数组合，进一步细分细胞亚群。

3. 统计分析

• 计算阳性细胞比例、平均荧光强度（MFI）等参数。

• 使用t检验、方差分析（ANOVA）等统计方法比较不同样本之间的差异。

4. 结果可视化

• 生成直方图、散点图、等高线图等，直观展示细胞群体的分布和比例。

• 使用热图（Heatmap）展示多参数数据的相关性。

五、应用实例

1. 免疫表型分析

• 通过CD3、CD4、CD8等标记，分析T细胞亚群的比例和功能状态。

• 检测肿瘤微环境中免疫细胞（如Treg、MDSC）的浸润情况。

2. 细胞周期分析

• 用PI或DAPI染色DNA，结合RNase A处理，分析细胞周期各时相的比例。

3. 细胞凋亡检测

• 使用Annexin V/PI双染法，区分早期凋亡、晚期凋亡和坏死细胞。

4. 干细胞鉴定

• 通过CD34、CD133等标记，分离和鉴定造血干细胞和祖细胞。

六、注意事项

1. 荧光染料选择

• 避免使用自发荧光较强的样本（如肝组织），或选择自发荧光低的染料（如Alexa Fluor系列）。

2. 实验对照

• 设置同型对照、荧光减一对照（FMO）和未染色对照，确保结果的特异性。

3. 仪器维护

• 定期校准流式细胞仪的光路和液路系统，确保检测的准确性。

4. 数据存储

• 将原始数据保存为FCS格式，便于后续分析和共享。

流式细胞术通过精确的样本制备、抗体染色、流式检测和数据分析，能够提供细胞群体的多参数信息，为生物医学研究提供重要支持。在实际操作中，需严格遵循实验流程，优化实验条件，确保结果的准确性和可重复性。