细胞培养污染自救手册：支原体/细菌/真菌识别术

细胞培养过程中，支原体、细菌和真菌污染是常见且棘手的问题。准确识别污染类型并采取针对性措施，是保障实验成功的关键。以下为三种污染的识别方法及应对策略。

一、支原体污染

特征：

• 肉眼观察：培养基通常澄清，但细胞生长缓慢、形态异常（如空泡化、聚团）。

• 显微镜观察：普通光学显微镜难以发现，需通过特殊染色或PCR检测。

• 检测方法：

1. DNA荧光染色法：使用Hoechst 33258染色，支原体DNA呈绿色荧光小点。

2. PCR检测：针对支原体16S rRNA基因设计引物，灵敏度高。

3. 培养法：将细胞培养液接种至支原体专用培养基（如SP4），37℃培养3天，观察“煎蛋样”菌落。

应对策略：

• 短期处理：使用支原体清除试剂（如MRA），连续处理14天。

• 长期预防：

• 定期检测细胞系（建议每3个月一次）。

• 使用支原体清除的胎牛血清（FBS）。

• 培养基中添加抗生素（如环丙沙星、米诺环素）。

二、细菌污染

特征：

• 肉眼观察：培养基快速变浑浊，pH下降（酚红指示剂变黄）。

• 显微镜观察：高倍镜下可见游动的小杆菌或球菌，背景有细小颗粒。

• 检测方法：

1. 革兰氏染色：区分革兰氏阳性菌（紫色）和阴性菌（红色）。

2. 细菌培养：取培养液接种至LB琼脂平板，37℃培养24小时，观察菌落形态。

应对策略：

• 紧急处理：立即丢弃污染细胞，用70%乙醇擦拭超净台和培养箱。

• 预防措施：

• 操作前紫外照射超净台30分钟。

• 培养基、PBS等试剂使用前过滤除菌（0.22μm滤膜）。

• 定期更换CO₂培养箱水盘中的水，并添加硫酸铜（1:1000）。

三、真菌污染

特征：

• 肉眼观察：培养基表面出现白色、灰色或绿色菌丝，pH上升（酚红指示剂变紫红色）。

• 显微镜观察：高倍镜下可见分支状菌丝，可能伴有孢子。

• 检测方法：

1. 直接镜检：取少量培养液制片，用乳酸酚棉蓝染色观察菌丝结构。

2. 真菌培养：接种至沙氏葡萄糖琼脂（SDA）平板，28℃培养3-5天，观察菌落形态。

应对策略：

• 紧急处理：丢弃污染细胞，用2%戊二醛熏蒸超净台和培养箱。

• 预防措施：

• 培养箱内放置抗真菌剂（如两性霉素B浸泡的纱布）。

• 避免在梅雨季节进行细胞传代。

• 定期检测培养箱湿度（建议控制在40%-60%）。

四、综合防控建议

1. 细胞系管理：

• 从ATCC等可靠来源获取细胞系，并进行STR基因分型验证。

• 液氮冻存备份，避免反复传代导致的污染风险。

2. 操作规范：

• 使用一次性移液管，避免交叉污染。

• 传代时提前预热培养基和PBS，减少操作时间。

3. 环境监测：

• 每月检测超净台空气沉降菌（建议≤10 CFU/皿）。

• 每季度检测培养箱内壁菌落总数（建议≤50 CFU/cm²）。

五、紧急情况处理流程

1. 发现污染：立即停止实验，标记污染细胞。

2. 隔离污染源：将污染细胞移至独立生物安全柜，避免扩散。

3. 全面消毒：

• 超净台：70%乙醇擦拭+紫外照射30分钟。

• 培养箱：2%戊二醛熏蒸12小时。

• 耗材：所有移液管、培养皿高压灭菌。

4. 溯源分析：检查近期使用的血清、培养基和试剂是否过期或污染。

六、常见误区与避坑指南

• 误区1：培养基浑浊一定是细菌污染。
  真相：支原体污染早期培养基可能澄清，需结合PCR检测。

• 误区2：过滤除菌可完全避免污染。
  真相：支原体（0.1-0.3μm）可通过0.22μm滤膜，需添加抗生素预防。

• 误区3：真菌污染仅需更换培养基。
  真相：真菌孢子可能附着在培养箱内壁，需彻底熏蒸消毒。

七、推荐工具与试剂

• 支原体检测：MycoAlert试剂盒（Lonza），15分钟出结果。

• 细菌过滤：Millex-GP滤器（0.22μm），适配15mL/50mL离心管。

• 真菌清除：Amphotericin B（两性霉素B），终浓度2.5μg/mL。

通过以上方法，可有效识别并应对细胞培养中的支原体、细菌和真菌污染，保障实验数据的可靠性和重复性。